Terapia de interferência por rna

Mais de duas décadas após a realização do primeiro teste clínico de terapia gênica em humanos e mais de 1.800 ensaios clínicos aprovados em todo o mundo, temos hoje muito conhecimento acumulado sobre esse tão comentado tratamento baseado na transferência de material genético.

O famoso primeiro experimento aconteceu em 1990, quando o médico norte-americano William French Anderson obteve autorização do FDA (do inglês, Food and Drug Administration), órgão do governo dos Estados Unidos responsável pelo controle de alimentos e medicamentos, para retirar células de pacientes, inserir nelas genes para expressarem uma enzima que estava ausente e, então, reinjetar essas células corrigidas nos doentes. Os pacientes eram duas crianças portadoras de uma síndrome rara e fatal que tem diversas causas genéticas: a imunodeficiência combinada grave. Os portadores dessa doença são conhecidos como crianças da bolha, em referência à necessidade de ficarem isolados. Suas alterações genéticas provocam deficiência de uma enzima indispensável para o desenvolvimento do sistema imune, resultando em grande suscetibilidade a infecções graves que, se não forem tratadas, levam à morte antes dos seis meses.

Embora esse teste não possa ser considerado um sucesso clínico por questões técnicas, ele foi um marco na história da terapia gênica, com resultados promissores. A partir de então, houve um aumento vertiginoso no número de estudos e nas perspectivas para uso terapêutico dos genes.

 

Manipulação genética

A terapia gênica pode ser simplificadamente definida como a introdução de material genético novo em células de um paciente com objetivo de substituir, manipular ou suplementar genes inativos ou disfuncionais, resultando em benefício terapêutico.

Com o decorrer dos estudos e, principalmente, após a morte de um paciente em 1999, a euforia inicial foi substituída pela consciência de que os obstáculos poderiam ser maiores do que o esperado. A partir de então, o emprego da terapia gênica no tratamento de diferentes doenças vem sendo estudado de forma mais cautelosa, o que tem levado a um amadurecimento real sobre o tema. A evolução e a sedimentação do conhecimento permitiram não só a proposição e a execução de protocolos clínicos mais embasados e promissores, como também deram base para a formulação de novas abordagens para terapia gênica. Entre elas, destaca-se a interferência por RNA (RNAi), processo que interfere na expressão dos genes nas células sem alterar seu material genético (DNA).

Toda a informação genética necessária para o funcionamento do organismo está ‘escrita’ no DNA, e sua leitura – ou expressão do gene – resulta na síntese de pro- teínas. Para sintetizar uma proteína, a informação do DNA é transcrita para um RNA mensageiro (RNAm), em um processo denominado transcrição. Esse RNAm é então lido pelos ribossomos (processo chamado tradução), levando à formação da proteína.


Para sintetizar uma proteína, a informação genética contida no DNA é transcrita para um RNA mensageiro (RNAm), em um processo denominado transcrição. Em seguida, esse RNAm é lido pelos ribossomos (processo chamado tradução), levando à formação da proteína

As proteínas são vitais para o funcionamento do organismo. No entanto, seu excesso ou sua falta podem provocar inúmeras doenças. Assim, o bloqueio na produção de proteínas específicas pelo processo de interferência por RNA é uma abordagem interessante para o tratamento de diversas doenças, como câncer, infecções virais, doenças inflamatórias, entre outras onde se verifica um excesso desnecessário da produção de algumas proteínas.

O processo de RNAi inicia-se com a geração de pequenas moléculas de RNA com duas fitas (cadeias de nucleotídeos interligadas) a partir da quebra de moléculas maiores de RNA também com duas fitas por uma enzima chamada Dicer. Essas pequenas moléculas de RNA com dupla fita, conhecidas como siRNA (do inglês, small interfering RNA), associam-se a proteínas celulares formando um complexo chamado RISC (do inglês, RNA Induced Silencing Complex). Após a formação do complexo, o siRNA é separado em duas fitas simples complementares (chamadas de sense e antisense). A fita antisense permanece ligada ao complexo e guia o reconhecimento do RNAm alvo (aquele que leva à produção da proteína maléfica ou em excesso). O RNAm alvo é degradado por esse complexo e, então, ocorre a inibição da produção da proteína.

Mecanismo de interferência por RNA: moléculas de RNA dupla fita inseridas nas células desencadeiam uma série de processos que levam à inibição da produção de proteínas

 

Primeiros passos

O processo de silenciamento de genes após a transcrição do material genético para o RNAm para bloquear a produção de proteínas foi descrito pela primeira vez no início da década de 1990, quando cientistas norte-americanos e europeus tentavam intensificar a coloração púrpura em petúnias pela introdução de genes. Porém, de modo surpreendente, eles obtiveram flores totalmente brancas ou irregular- mente coloridas, efeito do silenciamento tanto do gene inserido quanto daquele responsável pela pigmentação no organismo.

No mesmo período, outros cientistas norte-americanos estudavam a função de genes no verme nematoide Caenorhabditis elegans pela administração de fita antisense de RNA para bloquear a produção de uma proteína. Eles observaram que tanto a injeção da fita antisense de RNA quanto a da fita sense produziam o mesmo resultado.

Enquanto isso, os biólogos norte-americanos Andrew Fire e Craig Mello obtiveram resultados similares com a injeção das fitas sense e antisense de RNA separadamente para bloqueio de genes que resultaria em contração muscular do verme nematoide. Verificou-se, porém, uma maior contração muscular nesses vermes quando injetada a dupla fita de RNA, levando à descoberta do processo de interferência por RNA, em 1998. O feito rendeu aos dois pesquisadores o Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 2006.

A descoberta de RNAi em vermes nematoides, junto com a demonstração feita pelo grupo do bioquímico alemão Thomas Tuschl, em 2001, de que duplas fitas de RNA sintéticas são capazes de promover o silenciamento gênico em células de mamíferos, desencadearam uma revolução biotecnológica.

 

Múltiplas vantagens

A terapia por RNAi tem vá- rias vantagens em relação às terapias convencionais. A principal delas é que, em princípio, a produção de qual- quer proteína pode ser inibida pela administração de siRNA. Além disso, diferentemente dos fármacos con- vencionais, o siRNA é específico, ou seja, gera somente o bloqueio da produção da proteína de interesse, não afetando a síntese de proteínas com estruturas molecu- lares semelhantes, o que reduz possíveis efeitos adversos. Seu uso também é mais efetivo, pois uma única molécula de siRNA pode silenciar várias cópias de RNAm, respon- sável pela produção de várias moléculas da proteína.

O tratamento com RNAi também é vantajoso quando comparado à terapia com DNA, porque o siRNA é uma molécula menor do que o DNA, o que facilita sua entrada nas células, e não precisa ultrapassar a barreira do núcleo para agir.

Uma última vantagem é que o siRNA é uma molécula de fácil síntese e suas características físico-químicas não mudam, apesar de suas variações para atingir alvos distintos. Isso facilita o desenvolvimento de sistemas para liberação da molécula no organismo (soluções, cápsulas, nanopartículas, entre outros) para sua aplicação clínica. Com a mesma forma farmacêutica, é possível administrar siRNAs diferentes para bloquear genes distintos. Por exemplo, um grupo da Universidade Northeastern, nos Estados Unidos, desenvolveu um sistema de administração oral de diferentes siRNAs para o tratamento de doença inflamatória do intestino. Como vários genes podem estar envolvidos no desenvolvimento de determinada doença, a possibilidade de atacá-la por diversas frentes aumenta as chances de cura.

Desafios da terapia por RNAi Ao mesmo tempo em que as características físico-químicas similares são interessantes por permitirem que um mesmo sistema de liberação veicule diferentes siRNAs, elas tornam sua aplicação terapêutica um desafio. Isso porque, em comparação com fármacos tradicionais, o siRNA é uma molécula grande e encontra obstáculos para atravessar a membrana citoplasmática da célula. Além disso, é degradado pelas enzimas presentes no organismo.

As primeiras pesquisas clínicas com siRNA foram iniciadas em 2004 e usaram uma molécula específica para inibir a formação de novos vasos sanguíneos na retina de pacientes com degeneração macular relacionada à idade e edema macular diabético, doenças que causam perda de visão em milhões de idosos e diabéticos no mundo inteiro. Os estudos clínicos iniciais atestaram a segurança de uma única injeção intraocular de siRNA nos pacientes e os resultados encorajaram testes posteriores. Contudo, novos estudos em um grande número de pacientes mostraram a pouca eficácia da terapia em reduzir a perda da visão.

 

Solução para aplicação clínica

Para superar os desafios da aplicação clínica de siRNA, sistemas de liberação estão sendo amplamente estudados. Um sistema de liberação ideal deve proteger o siRNA da degradação enzimática, impedir sua eliminação rápida do organismo, guiar a liberação do siRNA para os tecidos-alvo (evitando toxicidade em outras regiões), facilitar sua entrada nas células-alvo e liberar o siRNA no citoplasma, para que a molécula, então, possa desempenhar seu papel. Com essas características em mente, grupos de pesquisa de todo o mundo estão estudando nanopartículas, micropartículas, sistemas lipídicos ou poliméricos, entre outros meios para administração do siRNA.

No Brasil, nosso grupo de pesquisa na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo trabalha no desenvolvimento de sistemas para aplicação local de siRNA. Entre os sistemas criados estão líquidos que se tornam gel em contato com o organismo, formando verdadeiros depósitos de liberação sustentada de siRNA. No momento, avalia-se a eficácia do tratamento de tumores sólidos na pele por meio da administração intratumoral de siRNA usando esses sistemas.

Nosso grupo também desenvolveu nanopartículas multifuncionais para aplicação de siRNA na pele para tratamento tópico de doenças inflamatórias como psoríase e vitiligo. Os resultados mostraram que as formulações são capazes de promover a penetração e a retenção do siRNA nas camadas mais profundas da pele. Sua aplicação tópica não causou irritação cutânea e foi eficaz no bloqueio da produção de proteínas específicas. Esses trabalhos fazem parte da rede de pesquisa ‘Nano- biotecnologia farmacêutica aplicada à terapia antisense (siRNA e microRNA): uma plataforma multidisciplinar na pesquisa de medicamentos para a terapia gênica de doenças cutâneas’, que reúne pesquisadores do Brasil e do exterior com o objetivo de ampliar as perspectivas dessa terapia inovadora para várias doenças e alterações cutâneas.

Renomados grupos de pesquisa do mundo estão estudando a terapia por RNAi para o tratamento das mais diversas doenças. Os resultados encorajam a continuidade dos estudos e mostram que o emprego de sistemas de liberação, especialmente aqueles que usam nanotecnologia, é uma abordagem promissora para alcançar o efeito terapêutico desejado. Diante disso, esperamos que, em um futuro próximo, a terapia por RNAi ajude a prevenir e tratar as mais diversas doenças.
 

Sugestões para leitura

BORGHETI-CARDOSO, L.N. et al. An in situ gelling liquid crystalline system based on monoglycerides and polyethylenimine for local delivery of siRNAs. European Journal of Pharmaceutical Sciences; 74:103-117, 2015.

MENCK, C.F.M. & VENTURA, A.M. Manipulando genes em busca de cura: o futuro da terapia gênica. Revista USP, 75:50-61, 2007.

PEREIRA, T.C. et al. Introdução à técnica de interferência por RNA – RNAi. Editora Cubo/SBG, 2013.

VICENTINI, F.T.M.C. et al. Delivery Systems and Local Administration Routes for Therapeutic siRNA. Pharmaceutical Research, 30:915–931, 2013.

VICENTINI, F.T.M.C. et al. Liquid crystalline phase nanodispersions enable skin delivery of siRNA. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 83:16-24, 2013.

Livia Neves Borgheti Cardoso
Livia Vieira Depieri
Maria Vitória Lopes Badra Bentley

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo

Fabiana T.M.C. Vicentini
Farmacore Biotecnologia Ltda

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